逆轉(zhuǎn)錄pcr的原理及主要過程
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愛揚教育
2022-01-24
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擴展資料
步驟:預(yù)變性:
破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結(jié)構(gòu)。使DNA充分變性,減少DNA 復(fù)雜結(jié)構(gòu)對擴增的影響,以利于引物更好的和模板結(jié)合,特別是對于基因組來源的DNA模板,最好不要吝嗇這個步驟。此外,在一些使用熱啟動Taq酶的反應(yīng)中,還可激活Taq酶,從而使PCR反應(yīng)得以順利進行。
變性——退火——延伸循環(huán):
模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準備;
模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;
引物的延伸:DNA模板——引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。(三)PCR儀擴增循環(huán)后72度延伸10分鐘。