2.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。 引物長(zhǎng)度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

　　3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

　　4.引物3′端要避開密碼子的第3位。 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。

　　5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。 引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。

　　6.堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。